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关于培养基pH值的那些事儿

发布时间: 2023-11-20

我们在学习和日常检验工作中经常说到的“pH”或“pH值”,其官方定义的名称是氢离子浓度指数(hydrogen ion concentration),它是表示氢离子浓度的一种方法,代表水溶液中氢离子浓度(活度)的常用对数的负值,即-lg[H+]。


培养基是指液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分,用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂)、鉴定或保持其活力的物质,而培养基的pH值是商品化脱水合成培养基质量控制的重要理化指标之一,微生物的生长不仅依赖丰富的营养,还需要在适宜的pH值范围内才能正常生长繁殖或体现其生化特性。因此,制备好的培养基pH值是否符合要求对于我们微生物检验有很重要的影响。


一、影响培养基pH的因素有哪些呢?


1、培养基的称量和溶解


按照标签用法中称量数称取培养基,根据实验需求调整配制体积。先加适量水,充分混合完全溶解,不可有团块,再加水至所需量。


国内外大多数培养基厂家的用法上都标明:灭菌前需要进行加热煮沸至完全溶解。这是因为加热煮沸后,培养基溶解较为均匀。如果灭菌前未进行加热灭菌,容易导致培养基的pH值变化不稳定,特别是含有琼脂的培养基。

       培养基配制用水应满足GB4789.28-2013中关于水质的要求,如配制用水不佳:偏酸或偏碱,或含离子较多,都可能导致培养基pH值出现偏差。


关于培养基pH值的那些事儿

图1 GB4789.28-2013 3.3.2 


关于培养基pH值的那些事儿

关于培养基pH值的那些事儿

图2 水质的电阻率



2、培养基的灭菌


应按照培养基标签上的灭菌条件进行灭菌,目前常见的灭菌方式有两种:湿热灭菌(高压灭菌)和煮沸灭菌。


由于市售高压蒸汽灭菌锅性能存在一定差异,且受装载需要灭菌物品的摆放及多少影响,灭菌过程的持续时间会不同。小型灭菌锅或装载较少时,灭菌时间较快,而一些大型灭菌锅或装载较满时,灭菌时间较长。灭菌时间的长短势必会对培养基的pH值造成一定程度的影响,特别是对于一些含糖量较高的培养基,其直接感官表现就是培养基颜色的加深。因此,在使用高压蒸汽灭菌锅时,应进行灭菌工艺验证(定期使用生物指示剂进行验证),且注意装载量及物品分布,灭菌后要采用适当的方式进行冷却,以防过度加热。


关于培养基pH值的那些事儿

图3 KINTEK品牌  

压力蒸汽灭菌生物指示剂(自含式)



3、培养基的保温及复溶


进行倾注的培养基一般灭菌后会进行保温,目前实验室常见的保温设备是水浴锅和保温箱。但长时间的保温会影响培养基的pH值,一般建议在50℃左右不超过4h,最长放置时间不能超过8h。


已凝固的培养基如使用需要复溶(已添加附加实际的培养基不能复溶),但加热的过程相当于增加了培养基的受热时间,培养基的pH值会受到一定程度的影响。因此,复溶后的培养基,pH值不能作为验收依据。


4、测量温度


水的电离受温度影响,加酸、加碱都能抑制水的电离。实验测得,在标准温度(25℃)和压力下,水分子电离出的H和OH数目在任何情况下始终是1×10-14,且两种离子的浓度都是1×10-7mol/L ,即pH=7。水的离子积常数定义为KW=[H+]·[OH-],其中,KW称作水的离子积常数,简称水的离子积,KW只随温度变化而变化,是温度常数。温度升高时,溶液中的离子游离数增多,pH值降低;反之,当温度降低时,离子游离减少,pH值升高。


培养基的pH值指的是灭菌后冷却至25℃时的测量值(GB4789.28-2013)。即便市售有些pH计具备温度补偿功能,也应该以实测温度25±0.5℃时的测量结果为准。


关于培养基pH值的那些事儿

图4 GB4789.28-2013 3.3.4



5、电极


pH电极根据所测样品的种类不同大概有上百种之多,微生物检测实验室常见的有三种,即液体电极、表面电极和固体电极。而受品牌、缓冲溶液配置、校准过程等因素的影响,pH计的准确度也会存在一定的误差,且不可避免。


二、如何正确测量pH值呢?


1、pH计的校正

按仪器使用说明对pH计进行校正。


2、pH值的测定及调整


(1)对样品进行测量前,用去离子水或蒸馏水清洗pH电极并用吸水纸擦干电极;

(2)将电极插入(表面电极需要使电极贴紧琼脂表面)灭菌冷却至25±0.5℃的待测样品中,待显示稳定后,读取样品的测量值,报告小数点后一位;

(3)更换待测样品时,用蒸馏水或去离子水冲洗pH电极并擦干。

(4)必要时在灭菌前进行pH值调整,一般使用浓度约为40 g/L(约1 mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整,则使用灭菌或除菌的溶液。


参考标准

1、宋昌彦,施杨,盛满钰.影响培养基pH值稳定性的因素分析[J].中国卫生检验杂志, 2015(9):5.DOI:CNKI:SUN:ZWJZ.0.2015-09-054.

2、赵贵明. 微生物培养基及其原材料质量控制[M].中国质检出版社,2018.

3、徐俊延.高压蒸汽灭菌锅使用中几个应注意的问题[J].食用菌, 2011(3):2.DOI:10.3969/j.issn.1000-8357.2011.03.038.

4、余芬,孙明波,沈伟,等.生物制品生产中6种常用液体培养基高压灭菌前后的pH变化特征分析[J].中国药品标准, 2015(3):5.DOI:CNKI:SUN:YPBZ.0.2015-03-007.

5、BS EN ISO10523:2012  Water quality —Determination of pH

6、GB5009.237—2016  食品pH值的测定

7、GB/T9724-2007  化学试剂pH值测定通则

8、GB/T11165-2005  实验室pH计

9、GB4789.28-2013  培养基和试剂的质量要求